单链构象多态性分析

更新时间:2023-12-12 14:10

单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)分析是利用DNA或RNA单链构象具有多态性的特点,结合PCR技术进行基因检测的一种分析技术,称为PCR-SSCP技术,用以分析微生物的遗传学特征和基因突变。由于毛细血管电泳技术能在数十分钟内将PCR扩增片断分离出双链及单链峰,仅有一个碱基差异的两条DNA也能得到较好的分离,说明毛细血管电泳技术用于PCR-CE-SSCP是一种快速、有效的筛选基因点突变的方法。采用细菌rRNA基因(16SrRNA 23SrRNA)分析,对微生物进行分类鉴定,对绝大多数血培养阳性分离株及分支杆菌属细菌的鉴定,均显示出良好的分辨效果。而且对结核分支杆菌的各种耐药基因检测,对喹诺酮类药物耐药决定区基因突变的检测已成为常用的方法。如用限制性内切酶水解PCR片断,还可进行限制性片断长度多态性分析,PCR-CE-SSCP技术在微生物分类、新种类鉴定、分子流行病学调查中均具有重要作用。

分析原理

聚合酶链反应-单链构象多态性分析(Single Strand Conformation Polymorphism Analysis of Polymerase Chain Reaction Products, PCR-SSCP)是近年来发展起来的一种基因分析方法。

PCR-SSCP分析的基本程序为:首先PCR扩增特定靶序列,然后将扩增产物变性为单链,进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外,更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下,DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定,其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要为氢键)来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同,甚至单个碱基不同,所形成的构象不同,电泳迁移率也不同。PCR产物变性后,单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳,靶DNA中含氮碱基置换,或数个碱基插入或缺失等改变时,因迁移率变化会出现泳动变位,从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见,PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术,它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。该技术已被广泛用于癌基因抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。

适用领域

为了高灵敏特异性地显示SSCP分析结果,现已发展多种PCR-SSCP技术,各有其优势及适用领域。例如,可以在PCR扩增中用同位素或荧光素等标记引物或核苷,也可以在电泳后用银染溴化乙锭染色以显示结果。这里将重点介绍最常用的放射性同位素PCR-SSCP法。在进行PCR扩增特定靶基因序列时,利用γ-32P-ATP标记引物或直接在PCR反应体系中加入α-32P-dCTP进行PCR扩增,使扩增产物带有同位素标记物,然后将扩增产物变性为单链进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影显示结果。利用引物标记或碱基掺入法使PCR扩增产物带有同位素标记物,均可使产物信号增强几个数量级。二者相比较,前者经济、扩增特异性强,多用于大样本的检测和筛选;后者操作简便,适于一般实验室开展,可用于小样本或大样本的检测和筛查。

碱基掺入法

试剂准备

⒈ PCR相关试剂

⒉ α-32P-dCTP

⒊ 30%聚丙烯酰胺(29:1):丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺 1g,溶于100ml ddH2O中,4 OC保存。

⒋ 10%过硫酸胺配制方法:1g 过硫酸胺,溶于10ml ddH2O中,4 OC保存(可用数周)。

⒌ TEMED(N,N,N,N’,N’-四甲基乙二胺

⒍ 5×TBE缓冲液:Tris碱54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA(pH 8.0) 20ml,加ddH2O至1000ml。

7.变性上样液:95% 甲酰胺、0.03%二甲苯青、0.05%溴酚蓝、 20mM EDTA(pH 8.0)

操作步骤

PCR扩增

反应总体积为10μl,在0.5ml微量离心管中加入下列反应成分:

10×buffer   1μl

dNTPmix   70μM

DNA模板 100ng

引物及Taq DNA酶 依实验设计要求按比例加入

α-32P-dCTP   0.1μl

加ddH2O至   10μl

按实验设计循环参数进行扩增,获取扩增产物。

⒉ 聚丙烯酰胺凝胶电泳

电泳槽玻璃板的处理:用洗涤剂清洗玻璃板,自来水反复冲净洗涤剂,双蒸水冲洗3次,晾干,95%乙醇擦拭,自然干燥。用棉签沾取SigmaCote涂于玻璃的贴胶面上, 5~10min后再用软纸擦拭除去多余的SigmaCote溶液。在两块玻璃内的两侧放好衬条对齐,用固定夹夹紧两块玻璃,并用玻璃胶带封边。

⑵ 制胶:按照被分离DNA片段的大小、含量及玻璃板、衬条的大小决定凝胶的浓度与体积,一般来讲使用5%~8%的凝胶较为合适。轻轻摇匀配制的胶液于真空抽气(开始时要缓慢)除气泡,加 35μl TEMED至聚丙烯酰胺混合液中,混匀。用10ml玻璃吸管或50ml注射器吸取胶液,将玻璃模具倾斜成60O角,缓慢注入两玻璃板间的空隙中,直至灌满模具顶部。立即插入相应的点样梳,(小心勿使梳齿下带进气泡,并且不要将梳齿全部插入胶内,留约2mm梳齿于玻璃板上端,以免拔梳时把胶孔拔断)。由于凝胶在聚合过程中有回缩,所以应小心添加些胶液于梳子处,水平放置,室温聚合1hr。将封口玻璃胶带掀去,放入电泳槽,凹型玻璃贴紧电泳缓冲液槽,用大号固定夹固定住两侧。在上下电泳槽内灌入 1×TBE电泳缓冲液。小心取出点样梳,用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔,以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。

⑶ 扩增产物的处理:将 PCR扩增产物与变性上样液按1:5的比例加入0.5ml 微量离心管中,混匀。样品上胶前应98 o C变性10min,立即冰浴骤冷。取约3~5μl变性样品(根据点样孔的大小决定上样量),以微量加样器上样,(上样时要注意不要有气泡冲散样品,而且速度要快,时间长了样品易于扩散)。

⑷ 电泳:电泳槽接上电极(上槽接负极,下槽接正极)开启电源,根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小,决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l~5V/cm电泳。

⑸ 剥胶:电泳结束后,倒弃电泳缓冲液,取下电泳胶玻璃,用塑料楔子从玻璃板底部一角小心分开玻璃,凝胶应附着在一块玻璃上,切去凝胶左上角,作为点样顺序标记。剪一张与玻璃同样大小的滤纸,严密覆盖于凝胶上,顺一个方向将凝胶缓慢取下,用保鲜膜盖于胶面并包好,避免膜和胶之间产生气泡或皱折,将凝胶固定在X线片夹中。

⑹放射自显影:在暗室中将X线片贴于胶面,盖严片夹,用黑布将X线片夹包裹,置-70OC放射自显影曝光时间根据同位素的强度而定,约 24h~10d。

⑺ 冲洗胶片从-70oC取出X线片夹,在暗室内迅速取出X线片,立即显影,以免使X线片上出现过多的冷凝水。(如果想再得到一张放射自显影影像,可立即在片夹中装一张新X线片并尽快放回到一70oC继续显影。如果来不及再加入新片即已出现冷凝水则应使样品凝胶和X线片夹都恢复到室温,并擦去冷凝水后再装入新的X线片)。依次按以下程序操作进行显影

X线片显影液显影 1-5min

水洗 lmin

定影液定影 5min

流动水冲洗 15min

所有使用液的温度应为18~20OC为宜。

注意事项

核酸片段的大小: 用于SSCP分析的核酸片段越小,检测的敏感性越高。对于500bp的片段,则仅能检出10%~30%的变异,因此,

⒉ 游离引物: 游离引物可能同 PCR产物结合而改变其泳动率,即使游离引物量为6nM都有明显影响。因此,应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引物扩增方法,尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物,减少游离引物的干扰。

⒊ 低浓度变性剂: 凝胶中加入低浓度的变性剂,如5%-10%甘油、5%尿素甲酸胺、10%二甲亚砜(DMSO)或蔗糖等有助于提高敏感性,可能是因为轻微改变单链DNA的构象,增加分子的表面积,降低单链DNA的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此,对同一序列使用2~3种条件做SSCP,可能提高敏感性。

⒋ 电泳温度: 一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素,温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象,从而影响突变的检出。室温下电泳适于大多数情况,但由于在电泳时温度会升高,为确保电泳温度相对恒定,应采取以下措施:减少凝胶厚度,降低电压,有效的空气冷却或循环水冷却等。

⒌ 凝胶的长度: 可用测序板进行SSCP分析,凝胶板长度在40cm以上。

⒍ 凝胶浓度及厚度: 凝胶浓度很重要,一般使用5%~8%的凝胶,凝胶浓度不同,突变带的相对位置也不相同,如果在进行未知突变种类的SSCP分析时,最好采用两种以上凝胶浓度,这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对SSCP分析也很重要,凝胶越厚,背景越深,在上样量较多的前提下,尽量使凝胶越薄越好。

假阴性: 一般认为,如没有污染,PCR-SSCP分析不存在假阳性结果,但可能出现假阴性结果,后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微,迁移率相差无几所致,尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照,结果可以重复确定的突变带是可信的,如果没有阳性对照,应经测序来确定其是否为突变带。由于PCR-SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过设置阳性对照,摸索电泳条件,假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未知基因变异的检测,假阴性结果就难以百分之百地消除。

8. 结果分析: 单链凝胶电泳时,互补单链迁移率不同,一般形成两条单链带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前,通过加热变性产生单链。如变性不彻底,残留双链亦可形成一条带.因此,PCR-SSCP分析结果至少显示三条带。但是,由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象,检出三条或四条单链带就不足为奇。

免责声明
隐私政策
用户协议
目录 22
0{{catalogNumber[index]}}. {{item.title}}
{{item.title}}